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Dres. María Inés Mota, Gustavo Varela, Br. María del Pilar Gadea y colaboradores ARTÍCULOS ORIGINALES
Rev Med Uruguay 2005; 21: 30-36
Serotipos, perfil plasmídico y antibiotipos de
cepas de Shigella flexneri aisladas de niños
menores de 5 años con diarrea sanguinolenta
usuarios de los servicios de Salud Pública
Dres. María Inés Mota*, Gustavo Varela†, Br. María del Pilar Gadea‡, Dra. María Inés Caffer¶, Lic. Alfredo Sirok*, Dr. Felipe Schelotto§ Departamento de Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina. Universidad de la República
Servicio de Enterobacterias. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI). Administración
Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS). Dr. Carlos G. Malbrán. Buenos Aires, Argentina
Introducción: en niños menores de 5 años con diarrea sanguinolenta, Shigella flexneri es elagente bacteriano más frecuentemente recuperado en nuestro medio. La shigellosis es una de lasenfermedades infecciosas en las cuales el tratamiento con antimicrobianos es efectivo. Laelección empírica del antimicrobiano adecuado es problemática debido a la resistencia deShigella a diversos antibióticos. Esta situación estimuló el interés en el desarrollo de vacunaspara el control de esta enfermedad. Debido a que algunas vacunas están orientadas a promoverla respuesta inmune serotipo específica, es importante establecer la distribución de los serotiposprevalentes en la población que interesa inmunizar. El objetivo de este estudio fue caracterizar50 cepas de Shigella flexneri aisladas a partir de niños con diarrea sanguinolenta, recuperadasen cuatro encuestas etiológicas de gastroenteritis.
Método: a cada una se le realizó: serotipificación, estudio del patrón de lipopolisacárido, perfilplasmídico y estudio de sensibilidad a diferentes antimicrobianos.
Resultados: los serotipos prevalentes fueron 2a, 3c, 4, 6, y 1. Se identificaron diez antibiotiposdiferentes. En los cultivos del serotipo 2a se hallaron tres patrones plasmídicos; el 5 fue el másfrecuente, seguido por el 6 y el 7. El análisis de la evolución de los antibiotipos circulantesmostró una tendencia hacia la aparición de tipos con mayor espectro de resistencia.
Conclusiones: vista esta evolución, y de acuerdo a los resultados obtenidos, resulta de interésensayar un inmunógeno que incluya los determinantes “O” específicos de los serotipos 2a, 1, 3c,4, 6 y el de Shigella sonnei.
Palabras clave:
SHIGELLA FLEXNERI - aislamiento e identificación.
DIARREA INFANTIL - microbiología.
SEROTIPIFICACIÓN. * Ayudante de clase. Departamento de Bacteriología y Virología y § Profesor Director. Departamento de Bacteriología y Virología.
Residente de Laboratorio. Facultad de Medicina. Instituto de Higie- Facultad de Medicina. Instituto de Higiene Arnoldo Berta. Univer- ne Arnoldo Berta. Universidad de la República. Montevideo, Uru- sidad de la República. Montevideo, Uruguay.
‡ Asistente del Departamento de Bacteriología y Virología. Facul- † Profesor Agregado. Departamento de Bacteriología y Virología.
tad de Medicina, Universidad de la República Facultad de Medicina. Instituto de Higiene Arnoldo Berta. Univer- Correspondencia: Dr. Gustavo Varela
sidad de la República. Montevideo, Uruguay.
Departamento de Bacteriología y Virología. Facultad de Medicina, ¶ Jefa del Servicio de Enterobacterias. Instituto Nacional de Enfer- Universidad de la República. Alfredo Navarro 3051. CP 11600.
medades Infecciosas (INEI). Administración Nacional de Labora- torios e Institutos de Salud (ANLIS). Dr. Carlos G. Malbrán. Buenos Serotipos, perfil plasmídico y antibiotipos de cepas de Shigella flexneri aisladas de niños menores de 5 años con diarrea sanguinolenta Introducción
en Montevideo entre 1989 y 2003 a partir de muestras dematerias fecales de niños menores de 5 años con diarrea La enfermedad diarreica es una causa importante de sanguinolenta. Las muestras procedían de cuatro encues- morbimortalidad en niños de los países menos desarrolla- tas etiológicas distintas de gastroenteritis infantiles, reali- dos. A nivel mundial esta enfermedad es responsable de zadas en 1989-1990; 1990-1994; 1999 y 2001-2003, respec- casi 25% del total de muertes que ocurren por año en tivamente, con muestras tomadas en el Centro Hospitala- niños menores de 5 años(1). El número anual de episodios rio Pereira Rossell, principal centro pediátrico público del de infección por Shigella en países en vía de desarrollo se país. Las cepas se identificaron por pruebas bioquímicas ha estimado en 163 millones, con un millón de defuncio- estándar(15). El serogrupo se determinó por la técnica de nes. Se considera que 70% de los casos reportados y 60% aglutinación en lámina utilizando antisueros policlonales de las muertes ocurren en niños menores de 5 años(2).
comerciales (Difco Laboratories. Detroit, USA). La seroti- La shigellosis es una de las enfermedades infecciosas pificación de las cepas se realizó con sueros absorbidos en las cuales el tratamiento con antimicrobianos es efecti- serotipo-específicos de la colección de nuestro laborato- vo. El uso de antibióticos adecuados disminuye la severi- rio(15). Para validar los procedimientos, varios cultivos fue- dad y duración de la enfermedad, reduce el período de ron enviados al laboratorio de enterobacterias del institu- excreción de los microorganismos y previene las compli- to Carlos Malbrán, donde se confirmaron los resultados caciones(3). Sin embargo, la elección empírica del antimi- crobiano es problemática debido fundamentalmente a laresistencia de Shigella a diversos antibióticos.
En general, el porcentaje de cepas resistentes a dos o más antimicrobianos es de 80%, y varía según las regio- El estudio del patrón de LPS se realizó según el procedi- nes analizadas(4-7). El aumento en la prevalencia de cepas miento de extracción descrito por Hictchok, con separa- de Shigella resistentes estimuló nuevamente el interés en ción por el sistema discontinuo de Laemmli en geles de el desarrollo y uso de vacunas efectivas para prevenir poliacrilamida a 12% sin SDS, y luego tinción con nitrato Debido a que algunas de las vacunas en desarrollo están orientadas a la estimulación de la respuesta inmune Estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos contra los determinantes antigénicos serotipo específi-cos del polisacárido “O” del lipopolisacárido (LPS)(8-10), Los ensayos se realizaron por la técnica de disco difusión es importante establecer la distribución de los serogrupos en agar Müller-Hinton, siguiendo las normas del National y los serotipos de Shigella prevalentes en la población a Committe for Clinical Laboratory Standars (NCCLS)(18). Los antibióticos probados fueron los siguientes: tetraciclina En nuestro país, y para niños con edades comprendi- (Tet), ceftriaxona (Ctx), ciprofloxacina (Cip), cefoxitina (Fox), das entre 1 y 4 años, la mortalidad por diarrea de presunta ampicilina (Amp), trimetoprim-sulfametoxazol (Stx), cloran- causa infecciosa se ubicó en el año 2001 en el cuarto lugar fenicol (Cm), ácido nalidíxico (Na), gentamicina (Gm) y de frecuencia, con una tasa específica de 0,5 por 100.000 nitrofurantoína (Fu) (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, habitantes(13). En niños con diarrea sanguinolenta y usua- rios de los servicios de Salud Pública, Shigella flexneri y Se utilizaron como cepas control Escherichia coli S. sonnei son los agentes bacterianos más frecuentemen- ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
te recuperados, seguidos por Campylobacter jejuni;Escherichia coli productor de toxinas tipo Shiga (STEC); Salmonella y Escherichia coli enteroinvasor (EIEC)(14).
El objetivo de este estudio fue caracterizar un conjun- Las cepas se sembraron en caldo Luria Bertani (Sigma to de cepas de Shigella flexneri aisladas a partir de niños Chemical Co.; St. Louis) y se incubaron toda la noche a con diarrea sanguinolenta atendidos en centros de Salud 37ºC con agitación. El ácido desoxirribonucleico (ADN) Pública, para avanzar con más fundamento en el manejo plasmídico se extrajo según el procedimiento de lisis terapéutico y en la prevención de estas infecciones.
alcalina(19). Los plásmidos obtenidos fueron analizados yvisualizados por electroforesis en geles de agarosa a 0,7% Material y método
con TBE 0,5X y tinción con bromuro de etidio.
Resultados
Se estudiaron 50 cepas de Shigella flexneri recuperadas Se recuperaron durante los cuatro períodos mencionados, Dres. María Inés Mota, Gustavo Varela, Br. María del Pilar Gadea y colaboradores además de las 50 cepas de Shigella flexneri estudiadas en (68%); nueve del serotipo 3c (18%); dos del serotipo 4 este trabajo, 25 cepas de Shigella sonnei, dos cepas de (4%); dos del serotipo 6 (4%); dos del serotipo 1 (4%) y Shigella dysenteriae (ambas del serotipo 2) y una cepa de Todas las cepas del serotipo 2a mostraron el mismo Dentro del serogrupo B la distribución general por patrón de LPS, a su vez diferente a los patrones de los serotipos fue la siguiente: 34 cepas eran del serotipo 2a otros serotipos ensayados. La figura 1 muestra algunosresultados representativos. Se observan las bandas ca- racterísticas, correspondientes a moléculas de LPS lisoque difieren de tamaño entre sí en una unidad repetitivadel antígeno polisacarídico O. La ubicación de la densi-dad máxima de bandas y la separación entre las mismasvaría para cada serotipo.
La distribución de los serotipos de Shigella flexneri en los diferentes períodos de estudio se muestra en lafigura 2. En todos los lapsos considerados fue predomi-nante el serotipo 2a; en 1989-1990 se presentaban minori-tariamente el 3c y el 6; en 1990-1994 el 4, el 1, y especial-mente el 3c; en 1999 ninguno y en 2001-2003 nuevamenteel 3c y el 1.
De acuerdo con los resultados de los ensayos de sen- sibilidad para ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina ytrimetoprim-sulfametoxazol, se identificaron 10 antibiotiposdiferentes que se designaron según su fecha de apari-ción: tipo A (sensible a Amp, Cm, Tet, Sxt) 17 cepas; tipoB (Cm, Sxt, Tet)R dos cepas; tipo C (Sxt, Amp, Tet)R unacepa; tipo D (Amp)R dos cepas; tipo E (Sxt)R una cepa;tipo F (Sxt, Amp)R una cepa; tipo G (Cm, Sxt; Amp, Tet)R 11cepas; tipo H (Cm, Amp, Tet)R 11 cepas; tipo I (Cm, Sxt, Figura 1. Patrón de LPS de algunos serotipos de Shigella
flexneri, por SDS-PAGE teñido con nitrato de plata. Carril 1,
Amp)R dos cepas y tipo J (Amp, Tet)R dos cepas.
Shigella flexneri serotipo 2a (cepa IH1); carril 2, Shigella Ninguna de las cepas de S. flexneri estudiadas mostró flexneri serotipo 2a (cepa IH24); carril 3 Shigella flexneri resistencia para ácido nalidíxico, ciprofloxacina, nitrofu- serotipo 6 (cepa IH7); carril 4, Shigella flexneri serotipo 3c rantoína, gentamicina, cefoxitina o ceftriaxona.
Figura 2. Distribución de los distintos serotipos de Shigella flexneri en los diferentes períodos de estudio
Serotipos, perfil plasmídico y antibiotipos de cepas de Shigella flexneri aisladas de niños menores de 5 años con diarrea sanguinolenta Figura 3. Distribución de los distintos antibiotipos de Shigella flexneri encontrados en los diferentes períodos de estudio. n:
número de cepas. A, (sensible a Amp, Cm, Tet, Sxt)S; B, (Cm, Sxt, Tet)R; C, (Sxt, Amp, Te)R; D, (Amp)R; E, (Sxt)R; F, (Sxt, Amp)R; G,
(Cm, Sxt; Amp, Tet)R; H, (Cm, Amp, Tet)R; I, (Cm, Sxt, Amp)R; J, (Amp, Tet)R. Amp, ampicilina; Sxt, trimetoprim-sulfametoxazol; Cm,
cloramfenicol ; Tet, tetraciclina.
Se encontraron siete patrones de perfil plasmídico. En las cepas de los serotipos 6, 1 y 3c se encontró en cadatipo un patrón predominante, designados 1, 2 y 5, respec-tivamente. En los cultivos del serotipo 2a, el patrón 5 fueel más frecuente (31 aislamientos) seguido por el 6 (doscepas) y el 7 (un aislamiento) (tabla 1). La figura 4 muestraresultados característicos de separación electroforética deplásmidos en gel de agarosa. Se observan tres perfilesdiferentes del serotipo 2a, el patrón predominante de co-rrida del tipo antigénico 3c y el único observado en elserotipo 1.
Discusión
Las infecciones por Shigella aparecen como un problemaimportante para los servicios de Salud Pública en Uru-guay, como sucede en otras regiones del mundo(2). Ennuestro medio este germen sigue siendo el agente Figura 4. Perfiles plasmídicos obtenidos por electroforesis en
bacteriano más frecuentemente recuperado a partir de ca- gel de agarosa a 0,7% y teñido con bromuro de etidio. Carril 1, sos de diarrea con sangre en niños menores de 5 años y serotipo 2a (cepa IH1); carril 2, serotipo 2a (cepa IH24); carril usuarios de los servicios de Salud Pública; se recupera en 3, serotipo 2a (cepa IH18); carril 4, serotipo 3c (cepa IH12);carril 5, serotipo 1 (cepa IH43) aproximadamente 20%-25% de los niños con esta enfer-medad(20). En el período 1990-2000 se aislaron de niños La distribución de los distintos antibiotipos encontra- atendidos en el Centro Hospitalario Pereira Rossell, 213 dos en los diferentes períodos de estudio se muestra en la cepas de Shigella(21). La mayoría correspondían a S. figura 3. Se observa la predominancia inicial del tipo A, flexneri y la situación parece ser diferente en niños usua- que era sensible a todos los antibióticos ensayados, y su rios de salud privada, en los cuales se han informado fre- progresiva desaparición posterior, con prevalencia cre- cuencias de recuperación de 4%(22).
ciente de los tipos G y H, de resistencia múltiple.
Como ocurre en otras regiones poco desarrolladas del Dres. María Inés Mota, Gustavo Varela, Br. María del Pilar Gadea y colaboradores Tabla 1. Características de las cepas de Shigella
Estas dos observaciones (estabilidad y predominancia flexneri aisladas de niños con diarrea sanguinolenta del tipo 2a) tendrían importancia, como discutiremos más abajo, para definir qué determinantes antigénicos deberíaincluir una vacuna para uso en este grupo de niños.
El estudio del perfil plasmídico mostró pocas diferen- cias dentro del conjunto de cepas del serotipo 2a (trespatrones distintos con un patrón predominante, el 5, como se muestra en la tabla 1). En los otros serotipos recupera- dos se encontró también una correspondencia importante entre tipo antigénico y perfil plasmídico. Aunque debe- mos tener en cuenta que el número de cepas estudiadas es bajo para estos serotipos, los resultados sugieren, en general, una cierta uniformidad en la distribución de los cultivos según el marcador plasmídico; el antibiotipo indi- ca sin embargo, una diversidad importante dentro de los diferentes serotipos (tabla 1). Es necesario complementar los resultados de análisis plasmídico con técnicas de ma- yor poder discriminatorio que permitan establecer simili- tudes o diferencias, o ambas, a nivel genético entre cepas del mismo serotipo, para definir líneas celulares prevalen- tes. Esto puede ser importante si se considera la posibili- dad de seleccionar las mismas en una estrategia de pre- Los estudios de sensibilidad in vitro mostraron glo- balmente una elevada resistencia de S. flexneri a los anti- microbianos más comúnmente utilizados en el tratamientode la shigelosis. Del total de las cepas estudiadas, 60% * De acuerdo con los resultados obtenidos por la técnica
de disco difusión: A (Amp, Cm, Tet, Sxt)S; B (Cm, Sxt, Tet)R;
fueron resistentes a ampicilina y 36% a trimetoprim-sulfa- C (Sxt, Amp, Tet)R; D (Amp)R; E (Sxt)R; F (Sxt, Amp)R;
metoxazol. En el período 2001-2003 el porcentaje de resis- G (Cm, Sxt; Amp, Tet)R; H (Cm, Amp, Tet)R; I (Cm, Sxt,
tencia para ampicilina fue de 94% y para trimetoprim-sul- Amp)R; J (Amp, Tet)R.
Amp, ampicilina; Sxt, trimetoprim-sulfametoxazol; Cm,
fametoxazol 44%, cifras claramente más altas que las re- gistradas en el año 1989: 10% y 30%, respectivamente.
† Según los patrones de bandas obtenidos por El intercambio de material genético entre cepas y la electroforesis en geles de agarosa a 0,7%.
presión de selección pueden explicar estos hechos. Lacombinación de sulfametoxazol y trimetoprim ha sido muy mundo, S. flexneri (grupo B) es el serogrupo predominan- usada en nuestro medio para el tratamiento de infecciones te, seguido por S. sonnei y S. boydii. pediátricas. Actualmente los antimicrobianos más frecuen- Durante todo el período de estudio se recuperaron en temente indicados en el Centro Hospitalario Pereira Rossell el Departamento de Bacteriología y Virología solamente son los betalactámicos, en orden, cefradina, aminopenici- dos cepas de Shigella dysenteriae, que fueron del seroti- linas, ceftriaxona y cefuroxime(23).
po 2(14,20). En otras regiones pobres, este serogrupo es Como era de esperar, el análisis de la evolución en el más común, y el serotipo predominante suele ser el 1(2).
tiempo de los antibiotipos circulantes mostró una clara Dentro del serogrupo B, el serotipo mayoritario y ais- tendencia hacia la aparición de tipos con mayor espectro lado en todos los períodos que incluye el estudio fue el de resistencia (G, H, I, con resistencia para cuatro y tres 2a. Si bien estos hallazgos coinciden con resultados en- antibióticos respectivamente, véase figura 3). Actualmen- contrados en otras partes del mundo(11) y en zonas defini- te circularían tres serotipos de S. flexneri: 2a el más fre- das de países de la región(12), existen diferencias impor- cuente, seguido por 3c y 1, y cinco antibiotipos diferen- tantes con respecto a la frecuencia relativa hallada para tes: G (Cm, Sxt, Amp, Tet)R, H (Cm, Amp, Tet)R , I (Cm, Sxt, Amp)R , J (Amp, Te)R y A (sensible a Amp, Cm, Tet, Sxt), Como sucede en otras regiones, los resultados obte- con predominio de los primeros. Quedarían como recur- nidos en esta población de niños sugieren una relativa sos para el tratamiento de las infecciones por estas cepas estabilidad en la distribución de los serotipos a lo largo de S. flexneri el ácido nalidíxico, la furazolidona o la ceftriaxona. Sin embargo, en lugares donde se utiliza el Serotipos, perfil plasmídico y antibiotipos de cepas de Shigella flexneri aisladas de niños menores de 5 años con diarrea sanguinolenta ácido nalidíxico es frecuente la aparición de cepas resis- rhea. Shigellosis is an infectious disease successfully tentes(6). En el caso de ceftriaxona, sólo se dispone de la treated with antibiotics. Empirical choice of the adequate preparación de uso parenteral y no existe en el mercado antibiotic is difficult due to Shigella-resistant antibiotics.
local furazolidona para uso en seres humanos.
This situation promoted the interest to develop vaccines El caso de Shigella sonnei sería diferente del de S. able to control the disease. Since many vaccines tend to flexneri. Como sucede en África y Asia(6), durante el pe- promote specific serotype immune response, it is impor- ríodo 2001-2003 sólo se recuperaron dos antibiotipos: tant to categorise prevalent serotypes in the population (Amp)R cuatro cepas y (Amp)S cinco cepas. Estos resulta- study. The aim of the study was to categorise 50 isolated dos llaman la atención, teniendo en cuenta la frecuente Shigella flexneri strains in infants with bloody diarrhea, variación en el tiempo de los diferentes antiobiotipos de collected in four etiologic surveys of gastroenteritis.
S. flexneri, y considerando también que varios elementos Methods: serotypification, lipopolysaccharide pat- genéticos móviles (plásmidos, transposones) hallados en terns, plasmid profile and sensitivity to different antibiot- cepas de Shigella son importantes en la diseminación de ics were carried out in each strain.
resistencia(24,25). S. sonnei podría estar expuesta a menor Results: prevalent serotypes were 2a, 3c, 4, 6, y 1. Ten presión de selección porque circula menos en el medio, different antibiotypes were identified. In serotype 2a, 3 los procesos que origina son menos severos y las consul- plasmidic patterns were found; 5 was the most frequent, tas con tratamiento instituido menos frecuentes.
followed by 6 and 7. Analyse of present antibiotypes Un aporte útil de este estudio es la información que showed a trend to an enlargement of the resistance range.
ofrece para la formulación de vacunas de aplicación en Conclusions: according to results, immunogen should niños usuarios de Salud Pública. De acuerdo con las ca- include specific “O” determinants for 2a, 1, 3c, 4, 6 and racterísticas del LPS se reconocen actualmente 47 seroti- pos dentro del género Shigella; por lo tanto parece pocopráctico construir y luego utilizar una vacuna multivalenteque los contenga a todos: es fundamental seleccionar los Résumé
El LPS de Shigella es importante como factor de viru- Introduction: chez des enfants de moins de 5 ans avec lencia y como inmunógeno potencial. Niveles críticos de diarrhée sanglante, Shigella flexneri est l’agent bactérien IgG sérica e IgA mucosa contra el dominio “O” específico le plus fréquemment repéré dans notre pays. La shigellose (O-SP) de este antígeno conferirían inmunidad serotipo est une des maladies infectieuses où le traitement avec específica para la shigelosis(26,27). Estudios en seres hu- antimicrobiens est effectif. Le choix empirique de manos mostraron que la inmunización con O-SP conjuga- l’antimicrobien adéquat est problématique étant donné la do con diferentes proteínas determinó aumentos signifi- résistance de Shigella à plusieurs antibiotiques. De là cativos en el nivel de anticuerpos (IgG) anti LPS(8). Te- l’intérêt pour le développement de vaccins pour contrôler niendo en cuenta las reacciones cruzadas que ocurren cette maladie. Certains vaccins visent à promouvoir la dentro de los serotipos incluidos en el serogrupo B (con réponse immune sérotype spécifique; il est donc important la excepción del 6), y los datos de ensayos clínicos que d’établir la distribution de sérotypes prévalents dans la apoyan o sugieren algún grado de protección cruzada(9), population à immuniser. Le but de cette étude est de el inmunógeno a ensayar para uso local debería incluir los caractériser 50 cèpes de Shigella flexneri isolées à partir O-SP de los serotipos 2a, 1, 3c, 4, 6 y también el de Shigella d’enfants avec diarrhée sanglante, récupérées à quatre sonnei. En caso de ser 100% efectivo, este inmunógeno enquêtes étiologiques de gastroentérite.
protegería a estos niños de la mayoría de las infecciones Méthodologie: on a réalisé pour chacune sérotypifica- tion, étude du code de lipopolysacaride, profil plasmidiqueet étude de sensibilité à de différents antimicrobiens.
Agradecimientos
Résultats: les sérotypes prévalents ont été 2a, 3c, 4, 6 et 1. On a identifié 10 antibiotypes différents. Dans les Al doctor Juan Alfonso Ayala Serrano (Universidad Au- cultures du sérotype 2a on a trouvé 3 patrons tónoma de Madrid, España) por la lectura crítica del ma- plasmidiques; le 5 en est le plus fréquent et après le 6 et le 7. L’analyse de l’évolution des antibiotypes circulants amontré une tendance vers l’apparition de types à plus Conclusions: il en résulte l’intérêt à essayer un Background: Shigella flexneri is the most frequent bac- immunogène qui inclut les déterminants “O” spécifiques terial agent in infants under 5 years old with bloody diar- des sérotypes 2a, 1, 3c, 4, 6 et celui de Shigella sonnei.
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Source: http://www.rmu.org.uy/revista/2005v1/art5.pdf