Bvs.sa.cr

Concentración natural de compuestos antimaláricos
en artrópodos tropicales (in vitro)
Misael Chinchilla-Carmona1,3, Olga Marta Guerrero Bermúdez1, Giselle Tamayo-Castillo2,4, Ana Sittenfeld Appel2,5, Alberto Jiménez-Somarribas2 & Idalia Valerio-Campos31 Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales, Departamento de Parasitología, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica 2060 San José, Costa Rica; [email protected] Unidad de Bioprospección, Instituto de Biodiversidad (INBio); [email protected] Departamento de Investigación, Universidad de Ciencias Médicas (UCIMED); [email protected] Escuela de Química, Universidad de Costa Rica.
Centro de Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica.
Recibido 17-X-2006. Corregido 06-IX-2007. Aceptado 20-XI-2007.
Abstract: Natural concentration of antimalaric components in Tropical arthropods (in vitro). Alcohol,
hexane and dichlorometane extracts of 751 samples of Costa Rican arthropods were studied for the presence of
antimalaric components. With Plasmodium berghei we set an in vitro model in which the effect of the extract
was determined by staining of the parasites with cresil brilliant blue. Active extracts at concentration of 50 mg
or less, were considered positive. Promissory extracts were found in the orders Lepidoptera (24.1%), Coleoptera
(32.8%), Hemiptera (38.5%) and Polydesmida (81.3%). Since most of the Lepidoptera samples were in the
immature stages, the relation with the host plant was analyzed. Cannaceae, Flacourtiaceae, Crisobalanaceae,
Lauraceae, Fagaceae, Ulmaceae, Rosaceae, Asteraceae, Rubiaceae, Lauraceae and Caprifoliaceae were related
with the Lepidoptera larvae, and an antimalaric effect has been reported in most of these families. In the orders
Polydesmida, Opiliones and Blattodea, the extract from adults also had some important effect, probably because
all of them fed on plants. Polydesmida and Opiliones have chemical substances that probably serve as defensive
purposes; these chemicals could also have some antiparasitic effect. Therefore, the detection of antimalaric
components in arthropod species led to the identification of plants with promissory antimalaric components.
Rev. Biol. Trop. 56 (2): 473-485. Epub 2008 June 30.
Key words: malaria, arthropod extracts, antimalaric activity, treatment.
probablemente debido a los procesos de inmi- tancia en la salud humana data de hace muchos gración poco controlados. Independientemente años y continúa siendo un flagelo de la huma- de la causa, esta enfermedad todavía permane- nidad (Bioland 2001). La cantidad de muertes ce en Costa Rica, como en muchas otras partes debidas a ella, especialmente causadas por la del mundo (Bioland 2001). Estos hechos man- especie Plasmodium falciparum, es un motivo tienen vigente la importancia, no sólo de una de preocupación en los países tropicales (WHO vigilancia epidemiológica sostenible, sino de la aplicación de los tratamientos más adecuados.
la lucha contra esta parasitosis que se llevó a que se usan contra la malaria, resaltan la clo- cabo en los años 60, 70 y 80, ésta se consi- roquina, la quinina y los antifolatos sulfas y deró prácticamente erradicada (Vargas 2001); pirimetamina (Rosenthal 1998, Marquiño et sin embargo, después de 1990 se observó al. 2003). Esta situación persiste a pesar de los un nuevo incremento en el número de casos más recientes intentos de encontrar productos Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 sintéticos, capaces de actuar a niveles más puntuales de acción, específicamente en la constitución molecular del parásito, así como Recolecta y procesamiento de los artró-
al proceso metabólico en cuanto a la actividad podos capturados. De acuerdo con los méto-
enzimática se refiere (Nzila et al. 2005a, Nzila dos de campo descritos previamente (Sittenfeld et al. 1999, Nielsen et al. 2004), se recolectaron La quinina que es un producto natural, sólo ejemplares de los órdenes y familias que se se usa en casos muy especiales debido a sus indican en el cuadro 1 para un total de 751 efectos secundarios, mientras que el parásito ha desarrollado resistencia a la cloroquina y más recientemente a las sulfas (Bioland 2001, probó para demostrar su posible actividad anti- Hastings 2004, Hyde 2005). Estas razones han malárica, se utilizaron extractos hexánicos y inducido a la búsqueda de medicina alterna- alcohólicos obtenidos con las técnicas descritas tiva, usando productos naturales obtenidos previamente (Chinchilla et al. 2001).
fundamentalmente de plantas (Murphy 1999, Bodeker 2000, Anthony et al. 2005, Basso et Análisis de laboratorio. La determinación
al. 2005, Kvist et al. 2006).
del efecto antimalárico de cada extracto fue rea- lizado in vitro de acuerdo con el procedimiento aprovechó una intensa recolecta de mate- previamente descrito (Chinchilla et al. 2001) rial entomológico realizado por el Instituto y que se explica brevemente. Ratones NGP (20-30 g) fueron inoculados i.p. con glóbulos (INBio), tendiente especialmente a realizar un rojos infectados con Plasmodium berghei; 8 inventario de artrópodos de este país y de paso, días después los animales fueron sangrados de obtener algunos productos activos de tipo bac- la cola y se preparó una suspensión con 3% a tericida, antiviral y reguladores inmunológicos, 5% de glóbulos rojos suspendidos en MEM entre otros (Sittenfeld et al. 1999, Nielsen et más 10% de suero fetal bovino. El uso de P. al. 2004). Usamos una mínima parte de ese berghei para este estudio se basa en las reco- material para estudiarlo en forma experimental mendaciones hechas por varios autores (Carter por su actividad contra agentes de la malaria, y Diggs 1977, Janse y Waters 2006). El extrac- utilizando para ello la especie Plasmodium to liofilizado fue disuelto en DMSO al 10% de berghei de naturaleza netamente murina.
manera que se obtuviera una concentración de Basados en estudios previos con extractos 1:10 (peso/volumen). Luego se realizaron dilu- de plantas (Castro et al. 1996, Chinchilla et al. ciones dobles de cada extracto, incorporando a 1998) y con la experiencia obtenida al desa- 50 μl de cada dilución, 200 μl de la solución rrollar técnicas para el análisis de extractos de de eritrocitos infectados. Las muestras se incu- artrópodos (Chinchilla et al. 1998, Chinchilla baron a 37 °C por 2 horas usando los controles et al. 2001) se estudiaron gran cantidad de negativos y positivos correspondientes. La familias y órdenes de artrópodos en busca de muerte de los parásitos fue determinada usando el colorante azul de cresil brillante al 1%, esta- El estudio pretende no sólo dar a conocer bleciendo el 50% o más de organismos teñidos un trabajo de más de 4 años, sino establecer alguna relación entre el extracto que presente algún efecto promisorio y la planta hospedero Análisis experimental. Para realizar un
del cual se alimenta el artrópodo. La comu- estudio que cubriera la mayoría de los paráme- nicación de los resultados constituye la meta tros considerados, se separaron las muestras de acuerdo con el tipo de extracción (alcohólica Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 Acción antimalárica de extractos de artrópodos de acuerdo con orden y familia. Estudio total o hexánica), los órdenes y familias correspon- Se consideraron extractos activos aquellos dientes a la actividad de cada extracto y el tipo en que el efecto antimalárico pudo ser demos- de estado evolutivo o productos estudiados en trado en 5 o menos de 5mg /ml. Extractos que fueron activos en concentraciones de más de 5 Luego se trató de establecer una relación y hasta 50 mg/ml, se consideraron parcialmente entre de los estractos de artrópodos “promiso- activos. Para establecer todas las relaciones del rios” y las plantas de las cuales se alimentan caso y ordenar todos los datos obtenidos se usó Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 siendo el más alto el del orden Lepidoptera del que además se estudiaron mayor número de extractos con alguna actividad antimalárica en Al establecer las categorías de activo (5 o los diferentes órdenes de artrópodos estudiados, < 5 mg/ml de actividad) y parcialmente activo de acuerdo con el tipo de extracción (alcohólica (>5 a 50 mg/ml de actividad) los números o hexánica y diclorometánica). Como esperado, se reducen totalmente como se observa en el los porcentajes de positividad son muy bajos, Cuadro 3. Los porcentajes más elevados se Acción antimalárica de extractos de artrópodos de acuerdo con el orden y tipo de extractos en 751 muestras *Porcentaje del total de muestras estudiadas.
Actividad antimalárica (mg /mL) in vitro de extractos de artrópodos de acuerdo con el orden y tipo de extracto * mg/mL mínimo con actividad antimalárica.
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 observan en Lepidoptera y Coleoptera, ya que provenientes de heces y estadíos larvales y pre- la extracción hexánica o diclorometánica arrojó pupales activas, eran positivos, independiente- resultados más altos de positividad.
centajes de muestras con alguna actividad (en hospederos de las larvas de Lepidoptera (mari- general) de acuerdo con los materiales estudia- posas) cuyos extractos presentaron alguna acti- dos en los diferentes órdenes a saber: formas vidad antimalárica importante. En este caso adultas, estadíos inmaduros (larvas, pupas) y se encuentra un gran variedad de familias de algunos productos (heces fundamentalmente). plantas asociadas con los insectos en estudio.
En ambos tipos de extracción se observa que el Finalmente la relación entre las familias número mayor de muestras positivas del Orden de plantas de hospederos y los materiales Lepidoptera fueron estadíos inmaduros, 19% provenientes de las mariposas encontrados para los extractos alcohólicos, 32.2% para los positivos se establecen en el cuadro 8. De hexánicos. Siguieron los productos (heces) con nuevo son los estados inmaduros los que pre- 17.6% y 18.7% respectivamente y finalmente dominan en su relación con casi todas las las muestras de los adultos con 7.9% y 31% de plantas, siguiéndole las heces de estas larvas. positividad. En los otros órdenes no existió un Adultos y pupas estuvieron relacionadas con Lepidoptera, se encontró un mayor número de extractos positivos como se muestra en el cua- dro 6. El mayor número de extractos positivos se encontró en la familia Saturniidae. Además se observó que un mayor número de extractos nó este trabajo tenía como principal objetivo Acción antimalárica in vitro de extractos alcohólicos de artrópodos de acuerdo con el orden y el material examinado Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 Acción antimalárica in vitro de extractos hexánicos de artrópodos de acuerdo con el orden y la procedencia del material examinado Extractos de diferentes materiales provenientes de las familias del orden Lepidoptera con actividad antimalárica *Larvas y prepupas.
**Pupas y adultos.
*** % del total de nuestras de Lepidoptera positivas (60).
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 Relación entre extractos de Lepidoptera con actividad antimalárica y las plantas de las cuales Heliocarpus appendiculatus Saturniidae Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 Extractos de diferentes materiales provenientes del orden Lepidoptera activos contra P. berghei de acuerdo con la familia de planta hospedero * Larvas y prepupas. ** Pupas y adultos.
determinar la presencia de productos activos En el cuadro 1 se muestra que los porcen- contra la malaria y otros organismos en un buen tajes más altos de positividad se encontraron número de géneros y especies de artrópodos en Lepidoptera (24.1%), Coleoptera (32.8%), (Sittenfeld et al.1999, Nielsen et al. 2004).
Hemiptera (38.5%) y Polydesmida (81.3%). Sin embargo al analizar los resultados se Adultos y formas inmaduras de todos estos notó una tendencia interesante en el sentido órdenes basan su alimentación en plantas de que el hallazgo de actividad antimalárica superiores (Diniz et al. 2002) o inferiores encontrada en el artrópodo no era quizá lo más (Venkatesha 2005) muchas de las cuales se importante. Más bien, la acción clave está en el han relacionado con alguna acción contra orga- papel de esos organismos como herramienta de nismos infecciosos (Antony et al. 2005) e concentración de los productos provenientes de inclusive propiamente contra malaria (Véanse las plantas que ingieren y digieren.
Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 Familia y géneros de plantas con actividad antimalárica reportadas en diferentes países, similares a las determinadas en este estudio (Cuadro 7 y 8) Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 Se encontró que los extractos hexánicos o las que se nutren las formas inmaduras de las diclorometánicos presentaron mayor actividad mariposas, además de la posibilidad de que las antimalárica que los alcohólicos (cuadros 2 y sustancias de defensa de los hospederos sean 3) lo cual concuerda con los hallazgos de otros las causantes del efecto antimalárico. La posi- investigadores (Gómez y Witte 2001, Nielsen tividad encontrada para extractos de adultos de 2004), probablemente porque un mayor núme- Blattodea y Coleoptera (Cuadro 1) y su rela- ro de componentes químicos activos contra ción con plantas puede explicarse de la siguien- malaria tales como derivados de ácidos grasos te manera. Las especies de la primera familia y terpenoides se encuentran en los de extractos (las cucarachas) son omnívoras y dentro de lo hexánicos (Murphy 1999, Nielsen 2004) y no que ingieren están materiales provenientes de en los alcohólicos. Dentro de los extractos de troncos y hongos en descomposición, lo que de Lepidoptera en que se encontró mayor acti- nuevo indicaría que es en las plantas en donde vidad antimalárica (cuadro 3), se observan existen compuestos con el efecto estudiado. En aquellos provenientes de estadíos inmaduros, cuanto a los abejones (orden Coleoptera) una fundamentalmente larvas y heces de estas lar- gran mayoría se alimentan de plantas de las vas, tal y como se demuestra en los cuadros 4, 5 cuales absorben su savia. Específicamente en y 6. Esto se explica porque los estadíos larvales el Orden Lepidoptera se determinó la relación son los que se alimentan directamente de hojas de sus familias y géneros con diversas familias de las plantas y entonces la concentración de y especies de plantas hospedero (Cuadro 7) las estos materiales por el insecto serían probable- cuales se relacionan también en mayor grado mente los responsables de esta actividad anti- con larvas y heces de las mariposas (Cuadro 6). malárica (Referencias en cuadro 9); las heces El hecho de que la acción antimalárica de estos son el producto de la digestión de esas hojas.
extractos pueda deberse a la relación alimenta- ria de los insectos con las plantas hospedero se trada en los adultos del orden Polydesmida, evidencia en el cuadro 9 en donde se relacionan familia Rhacodesmidae y del orden Opiliones. algunas de esas familias, e inclusive géneros Los organismos del primer orden, los llamados de las mismas, con actividad antimalárica milpiés, se alimentan de hojas secas o des- compuestas de muchas plantas inclusive de la familia Meliaceae, (Cárcamo et al. 2000), la nados se indica que la actividad antimalárica cual presenta algunos géneros con actividad fue encontrada en extractos de hojas de las antimalárica (Chinchilla et al. 1996). Además familias Malvaceae, Acanthaceae, Rutaceae, varias especies de este orden secretan sustan- Myrtaceae, Solanaceae, Fabaceae, Urticaceae cias de defensa (Cárcamo et al. 2000) cuya y Anacardiaceae. En el caso de las familias composición química podría ser la causante del Euphorbiaceae y Asteraceae la actividad fue efecto indicado. En cuanto a las especies del encontrada en toda la planta incluyendo las orden Opiliones, se ha encontrado que estos hojas. Éstas son precisamente el alimento de las organismos se alimentan de varias especies de artrópodos dentro de los que se incluye larvas De esta manera se llega en forma indirecta y adultos de lepidópteros, coleópteros y hemíp- a descubrir a través de los artrópodos estudia- teros fítófagos (Lawrence 1981, Santos et al. dos, familias, géneros y aún especies de plantas 2002), por lo cual estos podrían ser la fuente con actividad antimalárica. Queda por deter- indirecta de productos activos provenientes minar si los insectos son simples encargados de de plantas. También sabemos que estos orga- concentrar los productos activos antimaláricos, nismos producen sustancias de defensa dentro si además metabólicamente pueden transformar de las que se incluyen alcoholes, cetonas y los componentes químicos de la planta para dar quinonas (Kerzicnik 2001). Estos datos per- un producto antimalárico, o en última instancia, miten orientar el trabajo hacia las plantas, de ocurren ambos fenómenos, dependiendo de las Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. ISSN-0034-7744) Vol. 56 (2): 473-485, June 2008 familias de insectos y de la planta hospedero. Anacardiaceae, Rosaceae, Asteraceae, Rubiaceae, En algunas familias de plantas (Cannaceae, Lauraceae y Caprifoliaceae. Especies de casi todas estas Flacourtiaceae, Crisobalanaceae, Lauraceae, familias han sido reportadas con actividad antimalárica. En el caso de los órdenes Polydesmida, Opiliones y Blattodea, Fagaceae, Ulmaceae) a las que llegamos a tra- cuyas formas adultas presentaron alguna actividad contra P. vés de su relación con las larvas de Lepidoptera berghei, encontramos que todos esos grupos se alimentan (Cuadro 7 y 8), no encontramos referencia también de plantas. En el caso de Opiliones sus especies de actividad antimalárica. En estas plantas son predadores de lepidópteros, coleópteros, hemípteros debemos enfocar también las investigaciones fitófagos y otros artrópodos, además de que producen sustancias de defensas tales como alcoholes, cetonas y pues la confirmación de esta actividad podría quinonas, entre otros, todo lo cual podría explicar la activi- presentar un nuevo aporte al conocimiento dad encontrada. Algunas especies del Orden Polydesmida, de los productos naturales efectivos contra también secretan ciertas sustancias químicas, las cuales Plasmodium. Además, merecen un estudio más podrían tener un efecto antiparasitario. Así, a través de este detallado las sustancias de defensa producidas trabajo en artrópodos hemos llegado a identificar fuentes vegetales potenciales para componentes antimaláricos.
por las especies de los órdenes Polydesmida y Opiliones. Estudios para dilucidar estos aspec- Palabras claves: malaria, extractos de artrópodos, activi-
Adjobimey, T., I. Edayé, L. Lagnika, J. Gbenou, M. Este estudio fue realizado gracias al apoyo Moudachirou & A. Sanni. 2004. Activités antiplas- económico del Nacional Institute of Health modiales in vitro de quelques plantes antipaludi-ques de pharmacopée béninoise. C.R. Chimie 7: (Fogarty Internacional Center), proyecto N° 5U01TW/CA00312 y de la Vicerectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica, Agbaje, E.O. & A.O. Onabanjo. 1991. The effects of extracts of Enantia chlorantha in malaria. Ann. Trop. miento de los resultados del trabajo fue reali- Alvarez, G., A. Pabon, J. Carmona & S. Blair. 2004. zado en el Departamento de Investigación de la Evaluation of clastogenic potencial of the antima- Universidad de Ciencias Médicas (UCIMED).
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otros. Las formas inmaduras de Lepidoptera fueron las más positivas, por lo que se analizaron las plantas hos- Benoit-Vical, F., A. Valentin, V. Cournac, Y. Pélissier, M. pederos de donde se alimentaban dichos organismos. Las Mallié & J.M. Bastide. 1998. In vitro antiplasmodial familias de estas plantas eran Malvaceae, Acanthaceae, activity of stem and root extracts of Nauclea latifolia Rutaceae, Myrtaceae, Solanaceae, Fabaceae, Urticaceae, S.M. (Rubiaceae). J. Ethnopharm. 61: 173-188.
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Source: http://www.bvs.sa.cr/articulosexternos/art10.pdf